贵州省土壤暗色丝孢真菌属 种多样性分析-diversity analysis of

作者:admin 来源:未知 点击数: 发布时间:2019年10月24日

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  贵州省土壤暗色丝孢真菌属 种多样性分析-diversity analysis of soil dematiaceous hyphomycetes in guizhou province.docx

  贵州大学 贵州大学 2010 届硕士研究生学位论文333.4 讨论…………………………………… 86参考文献……………………………………………………………………………… 88致 谢…………………………… 96在读期间发表的文章…………………………… 97原创性声明……………………………………………………………………………… 98 PAGE PAGE 1贵州省土壤暗色丝孢真菌属、种生物多样性研究摘 要土壤真菌系指以土壤作为活动场所完成其全部或部分生活史的真菌,是土壤 生态系统的基础,存在丰富的多样性,其中半知菌种类最多,而暗色丝孢菌占半 知菌中的大部分。贵州气候温暖湿润,地形复杂多变,土壤类型多样,植被丰富, 土壤中蕴藏着丰富的真菌资源,本研究着重调查我国西南部贵州省土壤中的暗色 丝孢真菌,以期充分发掘贵州省的真菌资源,并进一步丰富物种多样性。从贵州省贵阳市、遵义市、赤水市、荔波县等市,县选取有代表性的地点, 共采集混合土样 90 多个,采用稀释平板法和土壤平板法分离获得 100 余个菌株,鉴定出暗色丝孢线 个。每种均作了 详细的形态描述、地点分布和显微镜下拍照,并对属级、种级特征,以及相似属、 种的区别进行了简要讨论。所分离鉴定出的暗色丝孢菌有:矛束霉属 Doratomyces 包括一个种小孢矛束 霉 Doratomyces microsporus,链格孢属 Alternaria 包括一个种链格孢 Alternaria alternata,节菱孢属 Arthrinium包括一个种蒙田节菱孢 Arthriniummontagnei,平 脐蠕孢属 Bipolaris 包括一个种麦根腐平脐蠕孢 Bipolaris sorokiniana,枝孢属 Cladosporium 包 括 两 个 种 细 极 枝 孢 Cladosporium tenuissimum、 芽 枝 状 枝 孢 CladosporiumcladospOrioideJ(Fries)de Vries,弯孢属 Curvularia 包括一个种新月 弯孢 Curvularialunata,粘鞭霉属 Gliomastix 包括一个种禾谷粘鞭霉 Gliomastix cerealis , 膝 梗 霉 属 Gonytrichum 包 括 一 个 种 巨 枝 膝 梗 霉 Gonytrichum macrocladium , 腐 殖 霉 属 Humicola 包 括 一 个 种 棕 黑 腐 殖 霉 Humicola fuscobrunnea,黑孢霉属 Nigrospora 包括一个种稻黑孢 Nigrosporaoryzae,小鼻 枝霉属 Rhinocladiella 包括一个种未定名小鼻枝霉 Rhinocladiella sp.,齿梗孢属 Scolecobasidium包括两个种隘缩齿梗孢 Scolecobasidiumconstrictum、多变齿梗孢 Scolecobasidium tshawytschae, 革 节 孢 属 Scytalidium 包 括 一 个 种 嗜 热 革 节 孢 Scytalidiumthermophilum,疣瓶孢属 Eladia包括一个种未定名疣瓶孢 Eladiasp., 葡萄穗霉属 Stachybotrys包括一个种纸葡萄穗霉 Stachybotryschartrum,圆孢霉属 Staphylotrichum 包括一个种大孢圆孢霉 Staphylotrichumcoccosporum,细基格孢 属 Ulocladium包括一个种黑细基格 Ulocladiumatrum,轮枝孢属 Verticillium包括一个种未定名轮枝孢 Verticilliumsp.,单格孢属 Monodictys 包括两个种大孢单格孢 Monodictys macrospora、 蒜 形 单 格 孢 Monodictys variabilis, 维 郎 那 霉 属 Vernonaea 包括一个种芭蕉维郎那霉 Veronaeamusae.,规整霉属 Codinaea 包括 一个种短囊状规整霉 Codinaeabrachysetula。两个新种是贵州腐殖霉 Humicola guizhouensis和土栖腐殖霉 H.terrestris所有研究过的分离系的各干制培养物均保存在贵州大学植物病理学标本室(HGUP),同时对活菌株进行了妥善保存。 关键词:贵州,土壤,暗色丝孢菌,分类研究,新种Biodiversity studies on genus and species of Soil Dematiaceous Hyphomycetes from Gui zhou Province of ChinaAbstractSoil fungi are those which have some part of or whole life cycle either in or directly associated with the soil environment. It is the basis of soil ecosystem and has abundant diversity. There have many kinds of Deuteromycotina among the soil fungi, while the Dematiaceous Hyphomycetes take the majority part of Deuteromycotina. The climate of Gui zhou province is warm and moist, the terrain is complex and changeable, the soil types are diverse and have many kinds of vegetation. Soil as a complex ecosystem, may contains plenty of fungi resource. This study focuses on investigating this group fungi in the Gui zhou province, in order to develop completely the resource of soil fungi and further enrich the diversity of the species.We selected representative sites, collected approximately or more than 90 soil samples from Guiyang City, Zunyi City, Chishui City, Libo County. We had got more than 100 isolates from those samples. The main isolation methods are soil plate methods and dilution plates methods. We had discovered 26 species which were included in 21 genera of dematiaceous hyphomycetes, among those findings, we had got two new species and three nameless species. All of these fungis were described in detail location, distribution and photographed under microscope. Meanwhile the differences of similar genus or species were briefly discussed.These 26 fungi are Doratomycesmicrosporus,Alternariaalternata,Arthriniummontagnei , Bipolaris sorokiniana, Cladosporium tenuissimum, Cladosporium cladospOrioideJ(Fries)de Vries,Curvularialunata,Gliomastixcerealis,Gonytrichum macrocladium,Humicola fuscobrunnea,Nigrospora oryzae,Rhinocladiella sp., Scolecobasidium constrictum, Scolecobasidium tshawytschae, Scytalidium thermophilum,Eladiasp.,Stachybotryschartrum,Staphylotrichumcoccosporum, Ulocladiumatrum,Verticilliumsp.,Monodictysmacrospora,Monodictysvariabilis, Veronaea musae., Codinaea brachysetula. The two new species are Humicola guizhouensis Bin Yang & Y.L. Jiang, sp. nov. and HumicolaterrestrisBin Yang & Y.L.Jiang, sp. nov.All dried cultures are deposited in the HGUP (Herbarum Guizhou University, Plant Pathology), at the same time all isolates are deposited properly.Key words: Guizhou China,soil,dematiaceous hyphomycetes,taxonomy,newspecies.第一章 文献综述1886 年,Adametz 自沙滩的表面和内层分离到 11 株真菌,这是最早关于土 壤真菌研究的记载。此后土壤线 年代以来,微生物 生态学研究发展较快,推动了土壤真菌学研究的发展,人们对探究土壤中真菌存 在的形式、数量、活性以及它们在物质转化中的重要作用等方面充满了兴趣。70 年代以后人们进一步认识到土壤真菌是微生物区系的主要成分,并具有较高的生 物活性。80 年代以后,由于逐渐采用新研究技术和手段,使得土壤真菌研究的 发展进入了一个新时期。1 土壤真菌的含义、分类及作用土壤真菌(soil fungi)是指土壤中具有 HYPERLINK /view/32163.htm 真核细胞的单细胞或多细胞分枝 丝状体或单细胞个体,属 HYPERLINK /view/77362.htm 真核生物。土壤真菌以土壤作为活动场所完成其全 部或部分生活史。广义的土壤真菌还包括森林表土腐朽植物和枯枝落叶层上的 HYPERLINK /view/38703.htm 真 菌 。 常 见 者 有 HYPERLINK /view/1931528.htm 藻 菌 纲 (Phycomycetes) 、 HYPERLINK /view/1931540.htm 子 囊 菌 纲 (Ascomyctes) 、 HYPERLINK /view/357919.htm 担 子 菌 纲(Basidiomycetes)及有性世代不明的半知菌属(Fungi imperfecti)等。上述菌 属大部分属于好气性 HYPERLINK /view/1931562.htm 腐生菌,有的则寄生在植物上并有致病性。真菌的 HYPERLINK /view/65671.htm 菌丝 具有分解有机物的能力,而 HYPERLINK /view/190518.htm 分生孢子和厚膜孢子却几乎没有这种能力。真菌 对土壤 pH 值的要求比放线菌和细菌所要求的低。可以认为真菌是酸性土壤 中特别是森林土壤中的主要分解者。土壤真菌可分为 HYPERLINK /view/1931704.htm 土壤习居菌和 HYPERLINK /view/1931759.htm 土壤寄居菌两类。前者在土壤中经常广泛 地存在,如 HYPERLINK /view/1931783.htm 腐殖霉属、 HYPERLINK /view/1692547.htm 毛霉属、 HYPERLINK /view/814112.htm 青霉 HYPERLINK /view/814112.htm 属等;后者是植物或动物的寄生菌。 土 壤真菌按具体生境又可把它们分为森林土壤真菌、耕地土壤真菌、荒地土壤 真菌、湿地土壤真菌、火烧土真菌等。按研究对象(如植物根)也可把它们 分为根围真菌、根表真菌、菌根真菌、维管束真菌等。如果按生理类型区分, 则可分为植物寄生菌、动物和人体寄生菌、纤维素分解真菌、木质素分解真 菌、果胶和半纤维素分解真菌、甲壳质(角素)分解真菌、 HYPERLINK /view/1932993.htm 糖真菌、捕食性 真菌等。多数土壤真菌分布广,在土壤表层 10cm 处含量最多,在 30cm 处仍有少 量的真菌存活,其数量和类型随着土壤深度的增加而减少,但是某些属种有 其最适宜的生境。青霉属、毛霉属的分布北方多于南方, HYPERLINK /view/1932979.htm 而 镰刀菌属、 HYPERLINK /view/1275548.htm 根霉 HYPERLINK /view/1275548.htm 属、 HYPERLINK /view/1931827.htm 异水霉属、 HYPERLINK /view/1932937.htm 笄霉属、 HYPERLINK /view/1041619.htm 曲霉属的分布则南方多于北方。土壤真菌的种类和数量以表土层和亚表土层为最多,随着土层的加深而逐渐减少,但青霉属、 曲霉属、毛霉属、被孢霉属、 HYPERLINK /view/1932972.htm 木霉属的某些种是常见的深土层分布菌。作为自然生态环境系统的成员之一,土壤真菌在生态系统中起着非常重 要的生理的、调节的以及生态的作用,对维持自然生态系统的平衡也起着举 足轻重的作用。Christensen(1989)简要概括了线 项功能,列表 如下:表 1.真菌在生态系统中的主要功能Table 1.Principle functions of fungi in ecosystem(1)分解有机质。(2)释放元素伴随分解,实现从有机和无机材料中对 N、P、K 等元素以及其他离子的矿化。(3)元素的存储。(4)加速基本元素和水分从土壤向植物根部的运输。(5)促进植物与植物之间基本元素和糖类的运动。(6)改变水分和离子通过植物地上部分的速度。(7)积累毒素。(8)改善土壤的通透性和促进聚集。(9)改善土壤离子的交换和持水力。(10)土壤的解毒,可能是物理或化学的改变,像降解、释放及螯和等。(11)合成腐殖质。(12)参与腐生食物链。(13)寄生与共生的鼓动。(14)互利共生,像菌根、地衣以及真菌与植物叶部,茎部及动物的互利共生。(15)捕食:包括捕食线虫线)产生环境中的生物化学物质,例如,许多抗生素和免疫抑制剂是线)通过侵蚀种子的外壳而促进种子发芽。(18)培育了酶或食物,如食虫真菌可以在真菌上生存,因为这类真菌能满足其营养需求。(19)提升和改变发展的小生境,如植物病原菌可以减少和消除生物区系内的种。(20)初步的风化作用,真菌与母质材料的接触可以促进离子进入生态系统。2 土壤中的暗色丝孢线 土壤中的暗色丝孢真菌暗色丝孢真菌(Dematiaceous Hyphomycetes)是丝孢类(Hyphomycetes)一 重要类群,在半知菌分类中居重要地位。在自然界中,该类群真菌主要以腐生、 共生或寄生方式生存繁衍,其中少数种是重要植物病原菌,常引起植物叶片、果 实、茎秆及种子病害,如链格孢属(AlternariaNees)的多个种易引起植物的多 种病害。研究表明几乎所有真菌均可生存于土壤、凋落枯枝(地表植物性凋落枯 枝)、海洋、江河或湖泊中,而且相当数量的暗色丝孢真菌适宜于土壤基质上生 存繁衍,如矛束霉属(Doratomyces Corda)、平脐蠕孢属(BipolarisShoemaker)、 枝孢属(CladosporiumLink)及弯孢属(CurvulariaBoedijn)等若干属、种。此 外,土壤真菌具有重要的生态学意义,对土壤腐殖质和土壤团粒结构的形成、对 自然生态系统中的纤维素、木质素降解及物质循环、能量转化等发挥着重要的作 用。2.2 土壤中暗色丝孢线 年 Adametz 从 沙 滩 的 表 面 和 内 层 分 离 到 11 株 线 年 Koning 和 Oudemans 对分离方法进行了改进,用麦芽汁或麦芽加琼 脂作为培养基,将土壤中的植物部分打碎后,制成悬浮液进行培养,得到 40 多个菌株。这应该是真正意义上的土壤真菌研究的开始,也是以后工作的基 础。目前,全世界学者已描述鉴定了 410 余个暗色丝孢线%以上属、种来源于土壤基质。学者们对土壤丝孢真菌类群的研究 也出版了几部专著,Gillman (1957), Barron (1968), Domsch et al., (1980), 这为深 入开展土壤丝孢真菌分类和挖掘有益菌种资源奠定了基础。但是,土壤暗色丝孢 真菌个体发育与分化程度易受植被结构、海拔、气候和人工培养条件的影响,而 且材料征集易受季节性、随机性和人为主观因素的制约,致使观察描述的个体分 类性状很难真实地反映属、种自然演化的本质特征,分类观点和界定标准难免存 在分歧与争议,必然干扰或制约着属、种的正确界定与命名,造成属、种的误定, 属、种名的混乱与同物异名现象。1956 年,Gillman 在其所著《土壤线 个种,包括 子囊菌、藻状菌及半知菌。1968 年,Barron 总结自己的研究结果,写成的《土壤中丝孢纲真菌的属》一书包含了丝孢纲线 种是暗色丝孢菌。Domsch 等,在 1980 年出版的专著中列出 159 个属,410 种,包括子囊菌,接合菌,藻状菌,担子菌和半知菌,其中的少数属已 划归于藻物界 (Chromista)。该书丝孢纲线 种。我国对凋落枯枝 暗色丝孢真菌研究较多,戴芳澜、邓叔群、周家帜(1936),魏景超(1941),戚 佩坤(1966、1994),白金铠(1966),郭英兰等(1979、1980),赵国柱等(2003、 2004、2005),张中义等(2003),张天宇等(2003)先后开展了部分凋落枯枝暗 色丝孢真菌属、种分类研究。但对土壤暗色丝孢线 年张天 宇等始开展了系统的全国土壤暗色丝孢真菌多样性研究,并相继发表了一些新 属、新种及中国新纪录属、种。在已知的全部丝孢纲真菌中,暗色丝孢菌占大 约 55%–60%。迄今已发表并被认可的 900 个左右的丝孢纲线 属主要存在于土壤中, 158 属主要生于林地或其他类型土壤中的植物脱 落物上,二者合计占全部丝孢菌的 32%;另有约 400 属丝孢菌的多数种生于 植物的茎、叶或树皮和木材上,最终或部分时期也会归于土壤中。因而土壤 中的丝孢菌是特别丰富的。另外英国、芬兰、瑞士等国家的研究资料表明, 真 菌 与 维 管 束 植 物 已 知 种 数 存 在 4:1 至 6:1 的 数 目 比 例 关 系 ( Hawksworth1991)。中国维管束植物近 30000 种,若按比例 6:1 的比例推算,线%,而中国实际可承认的线 种。 中国土壤中蕴藏着丰富的真菌资源,但我国研究相对滞后,亟待我们去调查 和挖掘其中的有用资源,这对丰富我国的物种资源,保护生物多样性有重要 意义。3 土壤的分散方法 最大限度的分散土壤是从土壤中分离提取微生物的关键。通常采用物理或化学方法,或是二者相结合的方法来达到微生物与土粒分离的目的。常用 的物理分散技术是使用玻璃珠与土壤悬液一起振荡,或使用韦林氏搅拌器 (Waringblender)搅拌分散,或是使用超声波分散土壤团聚体。物理机械分散 法常与化学分散法相结合,通过加入化学分散剂促进微生物与土粒的分离。 最常用的分散剂为 0.2%焦磷酸钠,其它分散剂还有 Winogradsky 盐溶液、Tris 缓冲液、生理盐水、六偏磷酸钠、胆酸钠、纯水;也有加入螯合剂和洗涤剂的。由于各种分散方法分散效果不同,采用何种分散方法效果最佳目前尚无一致结论。4 土壤线 分离方法土壤真菌的分离方法很多,主要有稀释平板法、土壤平板法、植物残渣 法、湿筛法、漂浮法、捕捉法、土壤淋洗法、钟形撒粉器法、埋管法、蒸气 法、菌丝分离法、直接分离法等。其中稀释平板法适用于分离产孢能力较高 的半知菌、子囊菌和接合菌,例如青霉属、曲霉属、拟青霉属、粘帚霉属、 镰孢属、枝顶孢属和枝孢属等,很少能分离到担子菌和无孢子真菌;土壤平 板法适用于分离在土壤中以菌丝状态存在的真菌,具有简便易行的优点;植 物残渣法适用于稀释平板法或土壤平板法不能分离的真菌,例如立枯丝核菌 (Rhizoctonia solani);湿筛法和漂浮法用于分离产生孢子囊的真菌;捕捉法可 用于分离腐霉属、疫霉属和丝核菌属的菌物;土壤淋洗法适用于分离腐霉属、 疫霉属、木霉属、枝顶孢属、镰孢属和毛壳菌属真菌或卵菌;钟形撒粉器法 可用来分离镰孢属真菌;埋管法适用于分离丝核菌属和葡萄孢属真菌;蒸气 法则适用于分离土壤中的子囊菌;此外,也可采用菌丝分离法和直接分离法 来分离不易产孢的真菌。综上所述,土壤真菌的分离方法有多种,但各有利弊,研究的过程中, 可以根据目的选择合适的方法,例如如果调查某地的真菌区系组成,就应选 择尽可能多的方法,相互补充,获得更多的真菌,全面反映该地土壤中真菌 的实际存在情况,但也要根据时间、人力、才力和物力的情况而定。土壤真 菌分离工作量大,耗时多,在我们的研究过程中选取了其中最常用的稀释法 结合土壤平板法,可以基本分离到取样地的线 培养基土壤内真菌种类繁多,它们的营养需要不同,因此常采用多种不同的培 养基作营养物质进行分离和培养。一般采用的培养基有无碳培养基、无碳培 养基加氨基酸、维生素、棉花纤维或植物组织、洋麻培养基以及孟加拉红培 养基等十几种培养基。其中孟加拉红琼脂培养基、牛胆汁琼脂培养基、马铃 薯琼脂培养基(PDA)和麦芽浸汁琼脂培养基(MEA)可兼用于土壤真菌的分离 PAGE PAGE 10和计数。孟加拉红琼脂培养基是一种组合培养基,成分准确,其上发育的真菌数量及种类较多,放线菌及大部分细菌易被盂加拉红和链霉素所抑制,但 真菌菌落较小,是最常用的土壤真菌分离和计数培养基。然而由于孟加拉红 琼脂培养基对真菌菌落和繁殖器官形成的限制以及染料影响,在原始平皿上 正常识别某些真菌,与酸性培养基相比,必须转移更多的菌落到其他的培养 基上。牛胆汁琼脂培养基上菌落发育不大,放线菌和细菌也全部被抑制,数 量准确,但由于结晶紫的影响,不易在培养基上直接鉴定。梁晨等在 1998年至 2000 年分离土壤真菌的工作中发现,松膏培养基和土壤浸汁琼脂培养 基(SEA)也适用于土壤真菌的分离和鉴定,其中松膏培养基具有强烈抑制放 线菌和细菌的作用,促进菌丝生长和孢子的形成,并且制备相对简便。在分 离的真菌种类方面,孟加拉红琼脂培养基和松膏培养基明显比马铃薯琼脂培 养基和土壤浸汁培养基多,其中松膏培养基上的菌落相对于孟加拉红琼脂培 养基上的菌落较大,且因能产生大量孢子而易于鉴定。分离土壤中植物病原 真菌常采用特殊的选择性培养基。例如没食子酸琼脂培养基和 HMI 培养基 (Himmi’s Modiifed Iscove’s Medium)可用于分离腐霉属和疫霉属卵菌。加 五氯硝基苯的培养基可用于分离镰孢属真菌。土壤浸出液选择性培养基和酒 精琼脂培养基可用于分离轮枝孢属真菌。由于真菌在土壤中除以菌丝状态存在外,还产生各种孢子和菌核等结 构;同时真菌既可存在于土壤团粒的内部或外部,又可存在于土壤中的植物 残体上。针对不同分离目的,可采用不同分离方法。同时对分离过程中所使 用的培养基,也可根据不同的研究目的有选择地加以使用。盂加拉红琼脂培 养基对于计数来说最常用,松膏培养基可兼顾计数、分离和鉴定,适用于大 多数土壤真菌和植物病原真菌的分离,尤其适宜于木生真菌的分离,并且孢 子与菌落同步形成,菌落不扩展,可获得较好的测数结果,是一种用途广泛 的培养基。5 土壤真菌的计数方法 土壤真菌的计数方法分直接计数法和间接计数法两种,分别测定总菌数和活菌数。直接计数法是将土壤真菌染色,在显微镜下计数的方法;间接计 数法是在培养基上培养,测定菌落数和根据真菌的活性反应而计数的方法。5.1 直接计数法直接计数法在近似土壤的条件下或以各种方法固定土壤后 ,再计数土壤 样本中的线 Rossi-Cholodny 埋片法:将载玻片埋在土壤中 ,经过一定时间后镜检测 定载玻片表面生长的微生物的半定量方法。线 倍,每枚 标本片观察 100~400 个视野,以检出真菌的视野数与总视野数之比表示生育 量(检出频率%)。此方法适用于测定不同时期不同土壤中真菌菌丝体丰度 ,然 而不能测定每单位重量土壤的菌数(生育量)。5.1.2 毛细管法:根据微生物利用土壤本身的毛细管系统输送的空气和养分 而生存的原理。将灭菌的毛细管插入融化的 0.2%琼脂中,然后安装在支架上, 插入土壤中,一定时间后取出,用 5%碳酸赤藓红染色,在显微镜下观察。此方法 能显示出天然生境下的微生物区系 ,并分离出许多未能为平板法所揭示的微 生物种,但得不出单位重量土壤中所含真菌数量。不过 ,反映出的数量仍可作 为不同土壤之间的相对比较。5.1.3 Jones-Mollison 法:将土壤悬浮液与溶化的琼脂充分混合,再制成玻片, 使土壤粒子与菌体均匀分散,提高测定总菌数的精确度。本方法适用于土壤中 的真菌的菌丝量的检出频率的测定。5.1.4 荧光显微观察法:上述 3 种显微镜直接计数法用酸性染料染色可将菌 体和土壤颗粒分开 ,但无法区分活菌和死菌。一般情况下 ,活菌比死菌吸收染 料少,在荧光镜下分别显示亮绿色和暗红色。此法可进行土壤真菌的定量测 定。常用的荧光染料有异硫氰酸、1-苯胺、8-萘酚磺酸镁盐、二醋酸盐和萘 啶酮酸,其中后两者只染活的微生物。5.1.5 荧光抗体法:用抗体和荧光素结合制成的荧光抗体试剂处理土壤样品 , 荧光抗体和存在于样品中的相应抗原产生特异性反应 ,在荧光显微镜下产生 特定的荧光。如果事先制备多种模式的荧光抗体。就可对土壤样品中的相应 抗原进行检验。并且荧光抗体可长期保存。本方法由荧光抗体的制备和荧光 抗体标本的染色两部分组成,适用于涂抹标本、印片标本、土壤本身、埋片和 土壤切片。真菌多使用菌丝的匀浆作为抗原来制备抗体。荧光抗体的染色方法有直接法、间接法及补体法等。本方法可进行土壤真菌的定量测定并且能够了解土壤线 电子显微镜直接观察法:利用电子显微镜观察土壤悬液 ,用热吸附法制 片,可观察到少见的真菌。此方法比稀释平板法的测定结果高几百倍。但改变 了土壤的自然状态,且不能得到纯培养,不能直接作菌种的鉴定。5.1.7 土壤切片法:利用各种固定剂在不破坏土壤结构的条件下将土壤样本 固定,制成观察微生物的剖面或玻片,再进行镜检。5.2 间接计数法5.2.1 稀释平板法:根据土壤中真菌的数量,一般采用的稀释度为 10-1–l0-3, 同时称取待测土样约 l0g 经 l05℃烘干 8h,置于干燥器中,待冷却后称重, 计算土壤含水量的百分数。用混菌法和刮刀法将土壤悬液接种在培养皿中, 重复 4 次,于 28–30℃恒温箱中培养 5–7d,选取菌落数在 10–100 的培养皿进 行计数(剔除扩散性真菌菌落占据琼脂表面 l5%以上的培养皿)。5.2.2 最 大概率数值法 :以烟草黑腐病菌根串珠霉 (Thielaviopsis basicola)为 例,取烘箱干燥土样 10g。用每毫升含 60μg 金霉素的灭菌蒸馏水配制每级 l0 倍的稀释液至 l0-5 或 l0-6。在铺有滤纸的培养皿内放 3 片 10mm 厚的胡萝卜片 用直径 2–3mm 的打孔器在上面打出一凹穴,加入稀释液 1mL,重复 3 次。 接 种 6–7d 后 , 记 录 发 病 胡 萝 卜 饼 数 目 。 若 2–6 次 稀 释 度 中 获 得 阳 性 结 果 (5,4,2,0,0)。以 pl 为 5,p2 为 4,p3 为的值,查表得近似值 2.2。5.2.3 土粒法:对于不产孢子的真菌,采用将土粒接种在选择性培养基上的 方法来分离计数。取少量土样加无菌水调成糊状,用圆头玻璃棒在平板上点 样,适温下培养一定时间后,观察生长情况,结果以百分数表示。此方法只 能得到不同土壤之间同类真菌数量的比较粗略的数据。直接计数法虽能比较真实地显示土壤中真菌的数量和分布状况的图景, 但难于鉴别真菌的种类和细胞的死活,而且不能得到纯培养。测量活菌数的 间接计数法由于使用的培养基的成分组成及物理性状和土壤大不相同,不能 使土壤中所有的真菌全部生长发育,虽然可获得纯培养,但是所得结果不论 在数量还是类群等方面,均不能反映自然状态下土壤真菌的全部真实情况。 直接计数法和间接计数法都存在着不同程度的局限性,然而不论采用任何一种方法,都能在一定程度上了解土壤真菌的数量和组成。土壤真菌总茵数和活菌数测定结果同时获得,对确切掌握土壤真菌区系的全貌必将有所裨益。6 土壤线 年,Hawksworth 对英国、芬兰、瑞士等国家维管束植物与真菌 之间数量关系的研究,真菌与维管束植物已知种数存在 4:1 至 6:1 的数量 比例关系。一般来讲,土壤中真菌的数量和种类随着土壤深度的增加而减少。 在 1g 肥沃表土中,真菌繁殖体的数量可达几千个到数十万个。最新研究估 计全世界线 万,但至今已被正式描述的只有 5%–10%,绝大 多数是未知的。其原因一方面在于对真菌分离培养技术的依赖,缺少对所有 真菌类群生物都适用的培养基和培养条件,不能从样品材料中分离出所有的 目标菌物;另一方面在于对真菌生活环境缺乏全面了解,不能准确地评价不 同地域(特别是热带雨林地区)线 生存环境的多样性 真菌广泛分布在各种各样的土壤环境中,包括农田、林地、草地、沼泽湿地、温泉热土和冻土层等。由于不同环境因子的影响,土壤真菌在其生活 环境中形成独特的群落种类、组成和分布规律。例如在林地中外生菌根真菌 的种类、数量较多,而在草地生态系统中丛枝菌根真菌的分布比较广泛。在 一些极端环境,如南北极的冻土层中则分布着较多的子囊菌;而温泉热土中 的真菌种类则可能与其他类型土壤,例如林地土壤中的优势种群几乎完全不 同。随着海拔高度的变化,土壤真菌的群落结构也发生变化。如 1991 年, 黄庆辉等研究表明,在海拔低于 1000m 的土壤中,主要的丝状真菌有青霉属 (Penicillium)、芽枝霉属(Cladosporiura)、弯孢属(Curvularia)及其他暗色丝孢 菌的属,在海拔高于 1000m 的土壤中主要有木霉属(Triehoderma)、青霉属等。 明显的群落区的分布特点是:随海拔升高,木霉属、青霉属等所占比例上升, 而 芽 枝 霉 属 、 弯 孢 属 等 暗 色 丝 孢 菌 属 的 数 量 和 比 例 有 所 下 降 , 曲 霉 属 (Aspergillus)及其他丝孢(非暗色)菌属的数量变化不很显著。进一步研究不同 植被对土壤丝状真菌的群落结构的影响表明,阔叶林地土壤真菌的多样性指数最大,其实际分布的菌属也最多,针叶林地土壤中菌属分布最均匀,而且以青霉属占绝对优势,即优势度指数最大。7 真菌分类技术在土壤真菌研究中的应用 早在数千年前真菌就已被人类认识和利用,但对线 多年的历史。此间,主要依据形态特征描述和鉴定真菌的属和种,并且 在比较形态学的基础上建立了一些分类系统。随着人类整体科学技术水平的 不断提高,真菌分类研究技术也得到了不断的发展、完善和补充,大大推动 了真菌分类研究的进展。到目前为止,已被描述的线 万 多种,而且还不断有新的线 传统分类方法经过多代线 多年的不懈努力,已形成了比较完善的真 菌分类体系,对科学研究和生产实践起着重要的指导作用。到目前为止,由 以形态学为主的传统分类方法为基础建立的分类系统在分类学界占据着举 足轻重的作用,99%的真菌属、种级分类单位仍然是建立在传统分类研究基 础上的,并仍在为人类认识真菌物种、了解和利用真菌资源发挥着重要作用。 不同真菌分类学家对一些分类特征的认识和理解不同,提出的真菌分类系统 就不同。具有较大影响的真菌分类系统有以 Ainswonh(1970)为代表的分类 系统、HawksWonh(1995)分类系统、Kirk(2001)分类系统、Alexopoulos(1996)分类系统及 Kendrick(2001)分类系统等。上述分类系统都基本上 是基于主要形态学为依据的传统分类方法。传统分类方法主要依据真菌的形 态、生理和生化特征等对真菌进行分类。尽管传统分类方法有一定的局限性, 但是,目前仍是相当有效而且可靠的方法,是大多数分类专家所乐于采用和 接受的,依然是发展其它现代分类方法的重要基础。离开传统分类系统和方 法这个基础,真菌分类学就会成为“无源之水,无本之木”。况且,传统分 类方法本身也正处于不断发展和完善的新阶段,并不排除采用分子生物学、 生理学、生态学和生物化学等学科的新进展和新方法,来不断地改进和提高 真菌分类研究工作。生物分类研究的目的是认识物种和客观地反映其系统演 化关系,无论将来的分类系统和方法多么先进,都无法摒弃以简明、节约为 主要优点,并在很大程度上反映客观实际的传统分类方法。7.2 现代分类技术在土壤真菌研究中的应用传统的分类方法主要依据于真菌的形态特征及细胞生理和生化等特性, 尤其是有性生殖阶段的形态特征。其主要困难是,在许多情况下某些真菌的 表型性状相对贫乏,难于透过现象认识其遗传本质。许多真菌有性生殖极少 发生,难以通过检查生殖隔离来界定物种。近年来多门新兴学科和技术的发 展,尤其是分子生物学技术的兴起极大地促进了真菌分类学的发展。以传统分类为基础,不断探求以现代生物技术为手段的综合分类研究方 法,实现传统分类方法与现代分类技术的有机结合,是未来真菌分类研究的 必由之路。8 本研究的意义 土壤真菌的种类相当广泛,几乎所有的真菌在土壤中都能找到,其中半知菌种类最多,而暗色丝孢菌占其中的大部分。因此中国土壤中的暗色丝孢 菌是非常丰富的。位于我国西部的贵州省属于高原山地,素有“八山一水一分 田”之说。贵州的气候温暖湿润,属亚热带湿润季风气候区,土壤面积共 159100 平方千米,占全省土地面积的 90.4%,土壤的地带性属中亚热带常绿阔叶林红壤—黄壤地带。中部及东部广大地区为湿润性常绿阔叶林带,以黄壤为主;西南部 为偏干性常绿阔叶林带,以红壤为主;西北部为具北亚热成分的常绿阔叶林带, 多为黄棕壤。贵州植被丰厚,具有明显的亚热带性质,组成种类繁多,区系成分 复杂。全省维管束植物(不含苔藓植物)共有 269 科、1655 属、6255 种(变种)。 由于特殊的地理位置,贵州植被类型多样,既有中国亚热带型的地带性植被常绿 阔叶林,又有近热带性质的沟谷季雨林、山地季雨林;既有寒温性亚高山针叶林, 又有暖性同地针叶林;既有大面积次生的落叶阔叶林,又有分布极为局限的珍贵 落叶林。植被在空间分布上又表现出明显的过渡性,从而使各种植被类型在地理 分布上相互重叠、错综,各种植被类型组合变得复杂多样。正是由于这种独特的 喀斯特地貌以及丰富的植被类型,孕育了大量已知及还不为人知的真菌种类。本 研究系统调查贵州省土壤中的暗色丝孢真菌,希望能够充分发掘贵州省的真菌资 源,进一步丰富该类群真菌的多样性。第二章 研究方法与结果分析1 材料与方法1.1 土样采集地的选择及土样采集为使本实验采集的土样种类既全面又具代表性,选取贵州省的植被保护区, 区内植被的多样性可以丰富土壤中暗色丝孢菌的类群,并且在土样采集过程中, 根据保护区里的不同海拔位置采集土样;另外,笔者还在农田、荷塘旁等地采集 土样,补充土样的多样性。2008 年 9 月—2009 年 8 月陆续完成茂兰自然保护区、竹海森林公园、桫椤 自然保护区、宽阔水自然保护区、遵义周边地区的耕作田、花溪公园、贵大农场 的农作物田、松林坡、天河潭风景区等地土样的采集,共采集土样 95 份。采样程序如下:将小铲用采样地点的土壤擦拭,除去地面的枯枝落叶等杂物 后,将表层 1–2cm 的土层铲去,取一定量土壤置于无菌的塑料带内,多点采集 的土壤进行充分混合后,取大约 100g 左右的混合土壤作为一个采集地点的混合 样品。1.2 土样的保存采集的土样带回实验室后及时置于 4℃冰箱保存,尽量在 2 个月内进行分离。1.3 培养基PDA配方:马铃薯 200g,葡萄糖 20g,琼脂 20g,蒸馏水 1000ml。PCA配方:马铃薯 200g,胡萝卜 200g,琼脂 20g,蒸馏水 1000ml。TWA+A配方:琼脂 15–20g,自来水 1000ml,灭菌后倒入培养皿中,加入灭菌的剪 成 4–6cm 的小麦杆。4)土壤浸出液培养基 配方:上述培养基在配置过程中,加入适量的土壤浸出液(一般 100mL,替 代同容积的水),然后,灭菌。1.4 土壤真菌的分离稀释平板法将保存的土样进行充分混合后,称取 10g,加入盛有 90mL 灭菌水的三 角瓶中,将三角瓶置于摇床上 110–130 转/分,振荡 20–25 分钟,使土壤颗粒 均匀分散于蒸馏水中,得到稀释倍数为 10 的土壤悬浮液;从中吸取 1mL 置 入装有 9mL 灭菌水的试管中,为稀释倍数为 102 的悬浮液。灭菌的水琼脂培 养基在冷却到 45℃左右时,加入链霉素 30μg/mL,氯霉素 3–5 滴,混匀,倒 入培养皿凝固降温后,将得到的稀释倍数为 102 的土壤悬浮液充分摇匀,吸 取 1mL,每培养皿滴入 4–6 滴,用灭菌的弯玻璃棒将其均匀涂抹后,将该培 养皿倒置于 25℃生化培养箱内培养,1 周后(根据经验,最好培养 15 天后), 视镜下观察。挑单个孢子到 PDA 培养基上(如果一种培养基上不生长,挑 到其它培养基上,如 PCA 培养基),纯化后,制干制培养物和玻片并保存菌 种。土壤平板法灭菌的小扁勺取土样 0.005g 左右,将其均匀散布在凝固的水琼脂培养基 上,或将 0.005g 左右土样置入培养皿后,倒入一定量无菌水,混匀后倒入冷 却至 40℃左右的水琼脂培养基,充分混匀。将培养皿倒置于 25℃生化培养 箱内培养,3–4d,培养皿内长出一定菌落后,将单个菌落挑出,移入另一培 养皿,于 PDA 培养基上培养。产孢后,挑出少量菌落制片观察,如果为暗 色丝孢菌,则挑单个孢子,于 PDA 培养基上继续纯化并制干制培养物和玻 片,保存菌种。1.5 简易促进产孢方法 从土壤中获得的分离物,常在培养后难于产孢。一般可以采取以下方法刺激产孢:(1)将纯培养的菌落用灭菌挑针划线或随机挖去几小块培养基, 进行刺伤刺激产孢;( 2)将其置入 4℃冰箱内冷冻;( 3)紫外线短期照射 刺激产孢;(4)将培养物干燥;(5)长时间放置;(6)12h 光照/12h 黑暗 交替,促进产孢;(7)用土壤浸出液培养基,增加了土壤成分,促进产孢。 1.6 分生孢子萌发及产孢方式观察挑取纯培养的菌落一小块,置于以水为浮载剂的凹玻片上,培养皿内加入少量无菌水,上面铺一层滤纸,弯的玻棒放入培养皿后,将凹玻片置于弯 玻棒上,6h 后,每隔 2–3h 观察,检查分生孢子的萌发情况。滤纸剪成比载玻片稍小的长方形,中间剪去形成一长方形的小孔,将其 置于载玻片上,放入培养皿灭菌后,挑取纯培养的菌落均匀置于滤纸上小孔 的周围,然后放入 25℃生化培养箱中培养,3–5d 后,取出载玻片显微镜下观 察分生孢子的着生方式,并拍照。1.7 描述鉴定纯菌种培养产孢后,挑取孢子及产孢梗,以乳酚油为浮载剂做玻片。在100 倍显微镜下观察,拍照,查阅原始文献进行鉴定。2 结果与分析2.1 束梗孢目(Stillbellales)—分生孢子梗聚生形成孢梗束1.矛束霉属Doooorrrraaaattttoooommmmyyyycccceeeessss Corda. in J. Sturm’s Deut. Fl. III 2 (7): 65-66, 1829.Stysanus Corda, Icon. Fung. 1: 21-22, 1837.在 早 期 文 献 中 该 属 见 之 于 Stysanus 名 下 。 Hguhes ( 1958 ) 提 出 以 Cephalotrichum 命 名 , 后 来 Morton 和 Smith ( 1963 ) 建 议 将 其 名 转 成 Dortomyces。该属内真菌的一个显著特点是形成明显的孢梗束,尽管目前公认的丝分 孢子真菌分类的一个主要依据是载孢体的类型,但有时孢梗束的形成并不很 稳,如该属内真菌的部分分离物在培养时,分生孢子梗比较松散,匍匍状, 而不形成明显的孢梗束,这一点同帚霉属 Scopulariopsis Bainier 相似,二者 的产孢方式相同,两个属的界限清,因而有人认为矛束霉属 Doratomyces 不 过是帚霉属的孢梗束时期,应该把它们划分在一个属内( Barron,1968)。 Barron(1968)年在研究该属内某些种类时,发现矛束霉属孢梗束阶段明显减 少,而且培养物明显具有 Scopulariopsis 时期,这和我们在培养过程中观察 到的现象一致。我们在对该属内土壤中的分离物培养过程中,也发现有些种的极个别分离物不出现孢梗束阶段,而是只有 Scopulariopsis 时期。如果不考虑载孢体的类型,那么这两个属只能靠其环痕梗的略微不同而区分。据 Mortan(1963)总结,帚霉属内真菌的环痕梗依据特点可以分为 4 个组,一般 呈圆柱形,有一个较长的环痕带,而该属内的真菌环痕梗绝少有圆柱形,一 般较短小,从基部至端部骤窄,这个时候两属易区分;但帚霉属内的真菌也 有少数种其环痕梗较短小,此时两属则不易区分。与该属近似的一个属为毛束霉属 Trichurus Clement & Shear,包括那些 形似 Stysanus Corda 属,但在产孢的头部可育菌丝中间产生不育刚毛的种, 二者唯一的区别仅在于该属真菌不形成刚毛。而 Barron(1968)不认同以上观 点,认为刚毛的形成与否不能区分两属,最终毛束霉 Trichurus 应该划在矛 束霉下 Doratomyces。该 属 的 模 式 种 Doratomyces stemonitis (Pers. Ex Fr.) F. J. Motron & G. Smith 为典型的复无性型真菌,其幼小时期产生具大瘤突的侧生芽孢子,决 不成链;随后,产生光滑链生的环痕孢子。黑棘瓶孢霉属 Echinobotryum 由 Corda 建立于 1831 年,当时只有一个种 即 E. atrum Corda,当时对该种描述为产生全壁芽生、球形但具有一细尖的 光滑分生孢子。1839 年,进一步澄清了该属的概念,订正该种的分生孢子表 面具有大的瘤突,而非光滑,并重新绘图。通过他的两次描述以及绘图,我 们都仅看到该种只全壁芽生产孢,而且明显形成束丝体。与该属相似的属为 Wardomyces 和 Mammaria,但后两者的种都具有萌发缝,因此,彼此可以区 分。但建属后相继发表的种,都被组合为其他的属或分类地位依然不明确。 如 E. pulvinatus, 后 来 观 察 到 分 生 孢 子 明 显 具 有 发 芽 缝 , 已 被 组 合 为 Wardomyces 内;E. olivaceum 产生无色的环痕孢子,明显不属于该属,可能 是 Scopulariopsis 的种;E.subterraneum 为 Raillo 在 1929 年描述的种,但该 种似乎应该划分为 Wardomyces,由于没有该种的原始材料,所以无法确认其 究 竟 应 该 规 为 那 个 属 。 迄 今 为 止 , 该 属 也 仅 包 括 一 个 种 即 模 式 种 E.atrum Corda。尽管 Corda 建属后没有提及该属内真菌为复无性菌,其相继发表的种也 都为单无性型菌,通过笔者所查阅的文献资料可以看出,该属一直以来被认 PAGE PAGE 20为全壁芽生产孢为特征( Ellis,1971),但 Hennebert (1968)检查了模式种E.atrum Corda 的 8 个分离物后发现,其中的三个在培养过程中不产生束丝体, 却在短的分生孢子梗上同时产生环痕孢子和侧生芽孢子两种类型的分生孢 子,同 Doratomyces stemonitis 一样。可能这种环痕孢子的产生需要一定的培 养条件,其产生的几率也可能不大,因而大多数研究者包括 Corda 在研究过 程中忽略了该现象。通过 Hennebert(1968)的补充以及我们对获得的分离物的 培养观察,认为 E. atrum Corda 同 D. stemonitis 应该为同一个种,据命名优 先律原则,其应为 D. stemonitis 的同物异名,相应的,E. atrum Corda 作为 Echinobotryum Corda 的模式种,该属也应为 Doratomyces 的异名。当然,这仅是笔者的一管之见,由于缺少该种的模式材料,我们无法深 入进一步研究该现象,关于 Echinobotryum Corda 的分类地位的正确划分有待 进一步研究。该属内的许多种是土壤中的常见种,尤其在富含有机质的地区存在更广泛。属级特征:菌落平展,灰色,褐色,黑褐色或黑色,绒毛状,絮状或粉状。菌丝体部分表生,部分埋生。子座无,刚毛和附属丝缺。分生孢子梗分化明显,束丝状,暗褐色至黑色,单根分生孢子梗直或弯曲,淡褐色或褐色, 大多数光滑,接近顶部分枝并扩展形成头部。产孢细胞单芽生,合生,端生 在分枝上,但大多数情况下离生,青霉状排列,层出,烧瓶形或安瓿形。分 生孢子链生,干燥,顶生,简单,椭圆形,卵形,倒卵形,球形或亚球形, 很少呈圆形,基部平截,端部钝圆或平截, 0-隔膜,其中 D. stemonitis 幼小 时期产生侧生芽孢子。模式种:Doratomyces stemonitis (Pers. Ex Fr.) F. J. Motron & G. Smith=D. neesii Corda。1.1 小孢矛束霉 图 1Doooorrrraaaattttoooommmmyyyycccceeeessss mmmmiiiiccccrrrroooossssppppoooorrrruuuussss (Sacc.) F.J. Morton & G. Smith, Mycol. Pap. 86: 77, 1963.For all synonymy, see F.J. Morton& G. Smith in Mycol. Pap. 86: 77, 1963.菌落平展,粉状,体视镜下清晰可见直立的孢梗束,灰绿色或灰褐色,背面褐色。生长速度中等,PDA 上,25℃下,2 周直径 2.5–3.5cm。菌丝体 大部分埋生,少表生。菌丝淡褐色或褐色,光滑,具隔膜,宽 1.5–2.5μm, 常形成菌丝束。孢梗束高 119–750μm,柄部暗褐色,由紧密压在一起的分生 孢子梗组成,头部圆柱形。也有小的孢梗束直接着生在菌丝上。环痕梗单生 或多个簇生在产孢小梗上,长 5.5–10μm,基部宽 3–4μm,至端部渐尖, 宽 1.5–2.5μm,无色,光滑。分生孢子卵形,端部多数尖,少数钝圆,基部钝, 淡棕色,聚集在一起呈暗褐色,光滑,2.9–6×3–3.8μm。贵州省荔波县茂兰自然保护区竹林下 ml6②,HGUP0813;贵大松林坡树 林下 sl4③,HGUP0930。世界分布:广布。图.1 小孢矛束霉 A-D: 分生孢子及分生孢子梗;(HGUP0813; 标尺=20μm) Fig. 1 Doratomyces microsporus (Sacc.) F.J. Morton & G. Smith. A-D: Conidia and conidophores; Bars: 20μm.讨论:该种的分生孢子形态与 D. purureofuscus (Schwein.) F.J. Morton& G.Smith 最为相似,但该种分生孢子大多数顶端尖,后者分生孢子顶端钝圆;该种 的分生孢子较后者(5–7.5×3.4–4.5μm)的要稍小。另外,该种的分生孢子形态 以及环痕梗都与 Scopulariopsiscarnonaria F.J. Morton & G. Smith 非常相似,区别 在于后者不形成孢梗束,这也是两个属的区别点之一。另外该种的环痕梗青霉状 排列在分生孢子小梗上,结构比较疏松,不象后者那般复杂。据报道其分离自森林土壤,尤其是枯枝落叶层,盐沼以及欧石南丛生的荒野,但分离的频率不是很高,更多见于各种植物材料以及甜菜的根际等( Domsch, Gams & Anderson,1980)。我们从多处土壤中分离到该菌,存在相对普遍。陈宗 泽等(1999)在国内首次报道了该种,分离自长白山木材的髓心内。2.2 丝孢目(Hyphomycetales)—分生孢子梗聚生本文包含的暗色丝孢菌分属检索表1、产孢细胞体生式产孢,孢子直接产生于菌丝上…………革节孢属 Scytalidium 产孢细胞芽生式产孢……………………………………………………………2 2、分生孢子内壁芽生式产孢………………………………………………………3分生孢子全壁芽生式产孢………………………………………………………16 3、分生孢子内壁芽生式产孢,产孢细胞合轴式延伸……………………………4分生孢子内壁芽生瓶梗式产孢…………………………………………………7 4、分生孢子蠕虫状…………………………………………………………………5分生孢子非蠕虫状,表面具纵、斜隔膜…………………………………………65、分生孢子内外壁都内褶形成真隔膜,中间一至两个细胞不等边膨大,使整个 孢子看起来向一侧弯曲………………………………………弯孢属 Curvularia 分生孢子仅内壁内褶形成假隔膜…………………………平脐蠕孢属 Bipolaris 6、分生孢子与产孢细胞接触点钝,分生孢子常具喙……….链格孢属 Alternaria分生孢子与产孢细胞接触点尖,…….………………细基格孢属 Ulocladium7 产 孢 瓶 体 常 环 绕 在 分 生 孢 子 梗 中 间 的 围 领 状 菌 丝 上…………………………………………………………膝梗孢属 Gonytrichum 产孢瓶体常成簇生于产孢梗顶端或者直接着生于菌丝上……………………88、产孢瓶体常成簇生于产孢梗顶端………………………………………………9产孢瓶体不成簇生于产孢梗顶端………………………………………………11 9、分生孢子淡褐色,常具有明显的“脊” ………………………疣瓶孢属 Eladia 分生孢子颜色较深,黑色或者黑褐色,不具类似的“脊” …………………10 10、分生孢子聚集形成粘性头部…………………………葡萄穗霉属 Stachybotrys分生孢子不聚集形成粘性头部………………………………………………1111 、 产 孢 瓶 体 单 生 , 决 不 簇 生 于 菌 丝 顶 端 的 分 枝 上 , 产 孢 细 胞 轮 生……………………………………………………………轮枝孢属 Verticillium 产孢细胞非轮生………………………………………………………………1212、 产孢细胞多瓶梗生…………………………………………规整霉属 Codinaea产孢细胞单瓶梗生……………………………………………………………13 13、 分生孢子梗常分枝,不形成厚垣孢子……………………粘鞭霉属 Gliomastix 分生孢子梗分化明显,高大,粗壮…………………………………………14 14、分生孢子梗分化明显,直立…………………………圆孢霉属 Staphylotrichum 分 生 孢 子 梗 顶 端 产 孢 细 胞 上 常 留 下 特 别 明 显 的 瘀 痕 , 孢 子 具 有 枝 孢……………………………………………………………枝孢属 Cladosporium15、分生孢子由多细胞组成,并具有纵横隔膜…………………………………16分生孢子不具纵横隔膜………………………………………………………17 16、 产孢细胞常膨大不呈齿状,分生孢子形状多变…………单格孢属 Monodicty分生孢子多芽生………………………………………………………………19 17、分生孢子常在隔膜处不加厚,分生孢子梗分化不明显………………………18在产孢梗顶端常留下许多产孢痕……………………………………………20 18、分生孢子黑色或黑褐色,椭球形或球形…………………黑孢霉属 Nigrospora分生孢子黄色或者黄色,球形或梨形………………………腐殖霉属Humicola19、分生孢子表面具裂缝………………………………………节菱孢属 Arthrinium分生孢子表面无裂缝…………………………………………………………20 20、分生孢子梗不分枝或罕见分枝……………………………维郎那霉属 Veronaea分生孢子梗不分枝或不规则分枝……………………………………………21 21 、 分 生 孢 子 梗 不 分 枝 或 不 规 则 分 枝 , 椭 圆 形 、 圆 柱 形 、 棍 棒 形 或 纺 锤形……………………………………………………小鼻枝霉属 Rhinocladiella 分 生 孢 子 梗 多 弯 曲 , 较 少 或 不 分 枝 , 产 孢 细 胞 具 齿 状 突……………………………………………………齿梗孢属 Scolecobasidium2 链格孢属AlllltttteeeerrrrnnnnarararariiiiaaaaC.G. Nees, 1816-1817. Das System Der Pilze, Plates: Tah. V. Fig. 68,1816; Das System Der Pilze 72, 1817.该属最初是由 Nees(1816)以 AlternariatenuisNees 为模式种建立的,但其图示未显示分生孢子的分隔情况,1 年后所给出的文字描述也没有充分体现该属的 特征。Fries(1832)建立另一个属 Macrosporium时,由于没有对该属一个确切的概 念,造成了后来两个属间分类上的混乱。Wiltshire(1938)在研究了两名称的基本 种后,认为 Macrosporium属不确切名称,并建议以 Chevallier(1836)引证的关于 A.tenuisNees 的含义为基准,将 AlternariaNees 作为针对 Macrosporium 的名称 而予以保留。随后,符合本属概念的以 Macrosporium命名的种陆续组合至该属 内。已经明确该属真菌的产孢方式为内壁芽生孔生式,产孢细胞合轴式延伸,此 可与产孢细胞环痕式延伸的匍柄霉属 Stemphylium区分开来;与该属近似的另一 个属为细基格孢属 Ulocladium,两者有时不容易区分,细微差别在于该属的分生 孢子基部钝圆,与产孢细胞接触面大;而后者分生孢子基部渐窄,与产孢细胞的 接触面小。该属内的线%以上兼性寄生植物,并引起多种植物病害,给农业生产 及贮运中的农产品造成重大损失。如 A.solani常危害番茄的叶、茎、果和马铃薯 地上部分和块茎;A.longipes引起烟草赤星病等,对烟草产业造成极大损失等。 有些种还可侵染人和动物,引起病害。但其作为植物残体的初级分解者,在自然 界物质循环中起重要作用,而且一些广布、广适性种可能有独特的酶系统和遗传 特性,很有可能是具潜力的生物资源。张天宇多年来致力于该类群真菌的研究,他主编的《中国真菌志:链格孢属》 已于 2003 年正式出版,其中描述了生在 57 科 144 属 228 种植物上的链格孢种及变种 123 个,专化型 2 个,大量研究的基础上,并结合前人的研究经验,总结了 该属真菌的种级分类标准,其中分生孢子是种级分类的主要依据,其大小、形状、 分隔、颜色、孢子表面的文饰、产孢表型等对种的区分具有重要的意义,并提出 “除了少数弱寄生广布种之外,以寄主植物科为定界的寄主范围应该作为链格孢 种级分类的标准之一,结合审慎的形态比较研究加以运用”的观点。该属的有性态已知为李维菌属 LewiaBarr & Simmons。 属级特征:菌落平展,粉状、棉絮状,初无色,后橄榄褐色或暗褐色。菌丝体大部分埋生,少量表生。菌丝有分枝,具隔膜,淡色至褐色。分生孢子梗端生或侧生于菌丝,直立,不分枝或有稀疏分枝,端部常随产孢屈膝式弯曲。产孢细 胞近球形、圆柱形,合生,多芽生,内壁芽生孔生式产孢,合轴式延伸。分生孢 子倒棍棒形、卵形、倒梨形、椭圆形或近圆柱状,基部钝圆,至端部渐窄,与产 孢细胞的接触面大。孢身淡褐色至暗褐色,光滑或具刺突、疣突,多纵、横及斜 隔膜,分隔处不隘缩或有不同程度隘缩。分生孢子无喙或有喙。模 式 种 : 链 格 孢 Alternaria alternata (Torula alternata Fr: Fr., A. tenusi C.G. Nees)。2.1 链格孢 图 2Alllltttteeeerrrrnnnnaaaarrrriiiiaaaaaaaalllltttteeeerrrrnnnnaaaattttaaaa (Fr.: Fr.) Keissler, Beih. Bot. Centr. 29: 434, 1912. Alternaria tenuis Ness, Syst. Pilze(Plates). Tab. V., Fig. 68; 1816 & Syst. Pilze, 72, 1817.Torula alternata Fries: Fries, Syst. Mycol. 3: 500, 1832.菌落平展,绒毛状,等径生长,灰色或灰褐色,生长速度中等,在 PCA 培养基上,25℃温度下,2 周直径达 3–6.5cm,背面观灰褐色至褐色。菌丝体 埋生或表生,菌丝无色或淡褐色,光滑,具隔膜,常分枝,宽 2–4μm。分生 孢子梗端生或侧生于菌丝,圆柱形,2–7 隔膜,单生或簇生,直立,直或弯 曲,常随产孢屈膝式弯曲。分生孢子单生或短链生,倒棍棒形,卵形或倒梨 形,淡褐色至褐色,光滑,偶见表面具小的刺突,3–7 横隔膜,1–4 纵隔膜, 1–2 斜隔膜,隔膜处通常不隘缩或者有时隘缩,11–42.5×7–13.5μm。具短喙,近圆柱状,常形成短柱状的假喙,生于分生孢子的端部或侧部,喙及假喙 5–16×3–4μm。贵州省荔波县茂兰自然保护区竹林下,ml1②,HGUP084;习水自然保护 区松林土下,xs3④,HGUP0830;贵大农场蔬菜地,gn3①,HGUP0945。世界分布:广布。 讨 论 : 该 种 作 为 属 的 模 式 种 , 属 于 广 布 的 主 要 小 孢 子 种 之 一 , 同 A.tenuissina 是两个分布极为广泛,对多变的环境条件和基质适应能力极强,常 作为植物的次生寄生菌,加速植物枯死,有时也引起重大经济损失。其还可产生毒素,引起人的白血球减少。该种常分布于森林和可耕地中,各种类型土壤表层土中更常见。还分离自小麦、大麦、燕麦、草莓、甘蔗等多种植物 及作物的根际。该真菌具有较强的纤维素分解能力。我们在研究过程中发现, 该种真菌在土壤中分布较为广泛,出现频率较高,因此在我国也是广布种。图.2 链格孢 A-D: 分生孢子及分生孢子梗;(HGUP084; 标尺=20μm)Fig. 2 Alternariaalternata(Fr.: Fr.) Keissler. A-D: Conidia and conidophores; Bars: 20μm.3 节菱孢属Arrrrtttthhhhrrrriiiinnnniiiiuuuummmm Kunze ex Fr., 1821; Kunze in Kunze & Schmidt, 1: 9. 1817; Fries, Syst. Mycol. 1:XLV, 1821.Camptoum Link, 1824, in Linné Sp. Pl., Ed. 4 (Willdenow’s), 6(1): 44.Goniosporium Link, 1824, ibid.: 45.Sporophleum Nees ex Link, 1824, ibid.: 45.Papularia Fr., 1825, Syst. Orb. Veg., 1: 195.Gonatosporium Cord., 1839, Icon. Fung., 3: 8.Microtypha Speg., 1910, An. Mus. Nac. Hist. Nat. B. Aires, 20: 432.Tureenia Hall, 1915, Phytopathology, 5: 57.Pseudobasidium Tengwall, 1824, Meded. Phytopath. Lab. Willie Commelin Scholten, 6: 38.Phaeoharziella Loubiédinées caseicoles (Théatospora van Beyma, 1929, Verh. K. Akad. Wet., Sect. 2, 26(4): 5. Racemosporium Mme. & F. Moreau, 1941, Revue Mycol., 6(N. S.): 8. Full synonymy given in Mycol. Pap. 103: 2, 1965.该属内的真菌一个最显著的特征就是从产孢梗母细胞上产生该组真菌特有的分生孢子梗,Hughs(1953)将其称为“basauxic conidiophores”,即 基部增长的分生孢子梗,并将其置入半知菌分为 8 个组(section)中的Ⅷ组, 描述该组的形态特征为:“分生孢子梗通过基部的一个生长点延长,从瓶状 或桶状的分生孢子梗母细胞上生出,常在分生孢子梗的发育之前形成一个不 规则端生的分生孢子。分生孢子单生在分生孢子梗顶部或不规则顶生在不断 延长的分生孢子梗的短柄上,或轮生在分生孢子梗增厚的隔膜间。分生孢子 以末端膨大的形式产生,老熟的孢子通常在顶端,而幼小的孢子在分生孢子 梗的基部”。然而有的人逐渐对 Hughs 这一分类观点产生了怀疑,Subramanian(1979) 指出,许多种真菌的产孢瓶体同该组的所谓产孢梗母细胞存在很多相似性, 随后,Minte(1982,1983,1984,1985)认为需要重新评价该组真菌的分类 地位,并分析了该属真菌分生孢子的发育过程,分生孢子、产孢梗母细胞、 分生孢子梗的形态及其培养表型,重新评价了该属及形似属的发育特征,在 此基础上,提出了该属产生两种分生孢子的假说。并用 Chalara,Mammaria 和 Wardomyces 等几个属的代表性种对该假说进行了验证,但他们没有变动 该组真菌的分类地位。按 Hughs ( 1953 ) 观 点 , 该 组 内 的 真 菌 还 有 以 下 几 个 属 : Cordella Spegazzini ,Pteroconium Saccardo 和 Graphora Poiteau 。 其 主 要 区 别 如 下 : Cordella Spegazzini 在丛生的分生孢子梗间产生刚毛;Pteroconium Saccardo ex Grove 形成分生孢子座;Endocalyx Berkeley & Broome 形成典型的基部增 长的分生孢子梗,但没有产孢梗母细胞形成,且其孢子由光滑到粗糙,有时 缺 萌 发 缝 ; Dictyoarthrinium Hughes 产 生 粗 糙 的 多 细 胞 的 分 生 孢 子 ; Spegazzinia Saccardo 在 分 生 孢 子 梗 上 仅 产 生 单 个 粗 糙 的 多 细 胞 孢 子 ; Graphiola Poiteau 尽管在形态上与该组内的真菌相似,但已经证实它是一种真正的担子菌(Col,e1983)。该组外与其近似的属为 Nigrospora Zimmermann,尽管按照 Hughes 传统的观点,该属没有产生典型的基部增长的分生孢子梗而可以轻易与该属区分,但二者存在许多相似性:都产生具萌发缝的暗色的 光滑单细胞孢子;在培养过程中都容易产生异常分生孢子等;具有强烈的分 生孢子弹射机制等,两属有时难以区分。Dictionary of the Fungi 9th 承 认 大 约 20 种 。 有 性 态 已 知 为 梨 孢 假 壳 属Apiospora Saccardo 和囊孢壳属 Physalospora Niessl。 属级特征:菌落紧凑或平铺,黑色或暗黑色。菌丝体部分表生,部分埋生。子座无,刚毛和附属丝缺。分生孢子梗基部增长,分化明显,从产孢梗 母细胞上单生,产孢梗母细胞近球形,烧瓶形,桶形或宽的棍棒形,简单, 长而窄,近圆柱形,常无色,当具有增厚的隔膜时呈褐色或深褐色。产孢细 胞合生,端生,或间生,多芽生,齿突状,小齿常短,圆柱形,基部平截。 分生孢子单生,侧生或端生,常扁平并具有无色或淡色的边缘或萌发缝,褐 色或深褐色,光滑,0-隔膜。不育细胞存在时常端生或近端生于分生孢子上, 常小,与分生孢子形状不同而且颜色要淡。模式种:Arthrinium caricicola Kunze & Schubert。3.1 蒙田节菱孢 图 3Arrrrtttthhhhrrrriiiinnnniiiiuuuummmmmmmmoooonnnnttttaaaaggggnnnneeeeiiii Sacc.,Nuvovo G. bot, itai.,7:306,1875.菌落平展,棉絮状,初白色,后灰色,背面灰褐色。扩展迅速,PDA 上, 25℃下,1 周直径 4.5–6cm。菌丝体大量表生,少量埋生。表生菌丝具隔膜, 多分枝,无色,光滑,宽 1–2.5μm;埋生菌丝无色,纤细,光滑,宽 1–1.5μm。 分生孢子梗简单,常针状,无色,光滑,长 2–4μm,极细,宽约 0.2–0.5μm。 分生孢子单生,端生于分生孢子梗或直接着生于未分化的营养菌丝上,呈小 扁豆形,在两边结合部位常具有一淡色的条带(萌发缝),直径 4.5–6.5μm, 侧面观,厚 3–4μm,褐色,光滑。贵州省贵阳市花溪公园杂草下,hg6①,HGUP0920。 世界分布:广布。讨论:据 Minter D.W. (1985)研究该属内的真菌产生两种类型的分生孢子梗, 第一种类型分生孢子梗较宽,具多隔膜,隔膜处明显增厚,颜色深;第二种分生孢子梗较窄,隔膜少,而且隔膜处不增厚;在培养过程种很少产生第一种类型的分生孢子梗,而是分生孢子直接着生在营养菌丝上,并缺少产孢梗母细胞。我们 所获得的分离物在培养过程中,也没有形成典型的具暗色隔膜的梗基增长的分生 孢子梗,但有产孢梗母细胞形成,较小,分生孢子梗极细,仅在孢子梗顶部着生 单 个 分 生 孢 子 , 未 见 侧 生 分 生 孢 子 的 情 况 。 该 种 的 分 生 孢 子 大 小 特 征 与 Arthrimiumstate of Apiosporamontagnei近似,产孢梗也有相同之处,但特征不很 明显,所以很难确定它们是否为同一个种,暂时不能确定其分类地位。图.3 蒙田节菱孢 A-C: 分生孢子及分生孢子梗;(HGUP0920; 标尺=10μm)Fig. 3 Arthrinium montagnei Sacc. A-C: Conidia and conidophores; Bars: 10μm.该属内真菌为世界性分布,存在于多种活植物或腐烂的植物材料上,尤其在禾本科植物上更常见,从土壤中分离并不多见(Larronndo & Calvo,1990)。仅 有 A.pheospermum 和 Arthrimium state of Apiosporamontagnei 2 个种经常分离自 土壤。Matsushima (1971,1975)先后从巴布亚新几内亚北部土壤中分离该属内一 种未定名的种,日本冲绳岛的土壤中分离到

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